细胞代次是指细胞从原代培养开始，经过多次传代培养过程中所经历的“世代”数目。这是一个非常重要的概念，因为它直接反映了细胞在体外培养过程中的“年龄”和状态。细胞代次的计量方式通常是用“P”后跟数字来表示，例如 P0、P1、P2……这里的“P”代表“Passage”，也就是传代的意思。

一、细胞代次的基本概念

（1）原代细胞与传代细胞的区别

原代细胞是从生物体组织中分离出来后直接进行体外培养的细胞，这些细胞保留了大部分组织的原始特性。它们具有以下特点：

· 生物学行为接近体内状态：原代细胞的基因表达、代谢特征以及对环境信号的响应等都更接近于体内细胞状态。例如，原代培养的肝细胞可能对药物代谢的反应与体内肝细胞较为一致。

· 保留组织特异性功能：一些具有特定功能的细胞在原代培养中仍能表现出部分功能特性。比如原代培养的神经元细胞，仍可以展现出一定的神经信号传导功能。

· 然而，原代细胞也有局限性，它们通常增殖能力有限，培养难度较大，且获取成本较高。因此，原代细胞往往用于特定的研究目的，如细胞分化机制的研究、组织特异性功能分析等。

传代细胞则是经过一次或多次传代培养后的细胞。细胞在传代过程中会逐渐适应体外培养环境，其特性可能会发生变化：

· 增殖能力增强：在适宜的培养条件下，传代细胞的增殖能力会显著增强，更适合大量扩增用于实验。

· 细胞形态可能改变：传代次数增多后，细胞的形态可能会发生改变。例如，一些贴壁生长的细胞可能会从多角形逐渐变为梭形。

· 基因表达谱微调：细胞在传代过程中，基因表达谱可能会发生一定的变化，以适应体外培养环境。这种变化在某些情况下可能会影响细胞的生物学功能。

· 可能失去部分原始特性：随着传代次数的增加，细胞可能会逐渐失去一些重要的原始功能特性。例如，一些原代培养的干细胞在多次传代后可能会逐渐失去自我更新和分化的能力。

（2）细胞代次的划分

细胞代次的划分是基于细胞的传代过程来定义的：

· 原代培养（P0）：从组织分离得到细胞后，在培养瓶中进行第一次培养直到细胞达到合适的密度进行传代的过程称为原代培养，代次标记为 P0。此时的细胞是初始的细胞群体，保留了最多的原始特性。

· 传代培养（P1、P2……）：细胞在 P0 代次达到合适的密度后，首次进行传代，此时进入 P1 代次。之后每进行一次传代，代次就增加 1，比如再次传代后进入 P2 代次，依此类推。传代培养的过程是细胞生物学实验中常用的细胞培养方式，适合进行各种细胞增殖、分化、功能等实验研究。

二、细胞传代次数的计算方法

传代次数的定义

在细胞培养过程中，传代次数的计算起点是从第一次传代开始计数的。具体来说，当原代培养的细胞（P0）达到合适的密度后，进行第一次传代操作，此时传代次数为 1，进入 P1 代次；接下来，每次进行传代操作，传代次数就加 1，进入下一个代次，比如从 P1 传代后进入 P2，从 P2 传代后进入 P3，以此类推。需要注意的是，传代次数的计算是累计的，与细胞的具体类型无关，无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，计算方式都是一样的。

实例演示

为了帮助大家更好地理解和掌握细胞传代次数的计算方法，我们通过以下一个具体的实验案例来进行详细说明，包括标记、记录和统计的具体操作步骤。

1. 准备工作

假设我们正在培养某一种贴壁生长的细胞，首先从组织分离得到细胞后，进行原代培养，将其标记为 P0。

2. 第一次传代

当 P0 培养的细胞长到培养瓶约 80% 的面积时，观察细胞状态良好，即可进行第一次传代。操作步骤如下：

（1）标记和记录：在传代前，先标记好新的培养瓶。例如，在新培养瓶上贴上标签，写上细胞类型、传代日期以及代次信息，这里代次标记为 P1。同时，在实验记录本或电子记录表格中记录相关信息，包括传代前细胞状态（如细胞密度、细胞形态等）、传代日期、传代倍数（假设按 1:3 比例传代）以及新的代次 P1。

（2）传代操作：先用胰酶消化 P0 培养的细胞，待细胞从培养瓶壁脱落下来后，加入适量的培养基终止消化，然后将细胞悬液分装到 3 个新的培养瓶中，每个新培养瓶加入适量的培养基，轻轻摇晃使细胞均匀分布，然后将培养瓶放入培养箱中继续培养。

3. 第二次传代

当 P1 培养的细胞再次长到培养瓶约 80% 的面积时，即可进行第二次传代。操作步骤与第一次传代类似：

（1）标记和记录：在新的培养瓶上标记为 P2，并在记录本或电子表格中记录传代日期、传代倍数（假设还是按 1:3 比例传代）以及新的代次 P2。同时，观察并记录 P1 代次细胞在传代前的细胞状态是否与 P0 代次有明显变化，比如细胞形态是否稍有改变，增殖速度是否有所加快等。

（2）传代操作：用胰酶消化 P1 培养的细胞，待细胞脱落下来后，加入培养基终止消化，将细胞悬液分装到 3 个新的培养瓶中，每个新培养瓶加入适量培养基，轻轻摇晃使细胞均匀分布，然后放入培养箱继续培养。

通过以上步骤，每次传代操作后，代次都相应增加，记录一定要详细准确，这样就可以清楚地知道细胞的传代次数以及各代次细胞的相关情况，便于后续的实验分析和使用。

常见误区

在实际的细胞培养实验中，很多新手科研人员在计算细胞传代次数时会犯一些常见的错误，这些错误可能会导致细胞代次管理混乱，进而影响实验结果的准确性和重复性。以下是一些常见的误区以及如何避免它们的方法：

1. 重复计数

有的实验人员在进行多次传代操作后，可能会不小心重复计数某一次传代，导致计算的代次偏高。为了避免这种情况，建议在每次传代操作时，都仔细核对记录本或电子表格中的代次信息，确保传代次数的累加是准确的。同时，在标记培养瓶时，也可以在瓶身上清楚地写上传代次数，方便随时查看和核对。

2. 遗漏计数

与重复计数相反，还有的实验人员可能会在进行某次传代操作后忘记记录传代次数，或者在记录时出现疏忽，导致代次遗漏，从而使计算的代次偏低。为了避免这种错误，在每次传代操作后，都应该立即记录相关信息，包括传代日期、传代倍数以及新的代次等。可以使用固定的记录格式，比如在实验记录本或电子表格中设置专门的记录模板，确保每次传代的信息都完整记录，避免遗漏。

三、细胞代次对实验的影响

（一）细胞特性变化

随着细胞传代次数的增加，细胞的生物学特性会发生一系列变化，这些变化可能会影响实验结果的准确性和可靠性。

1. 形态学变化

不同代次的细胞在形态上可能会有明显差异。例如，原代细胞（P0）通常保留了组织来源的细胞形态特征，而传代后的细胞（如P1、P2及以上）可能会逐渐失去这种特征。以人皮肤成纤维细胞为例，P0代次的细胞形态多为不规则的多角形，边缘清晰；但随着传代次数增加，细胞可能会变得更加细长，形态趋于一致。这种形态变化可能暗示细胞的生理状态发生了改变。

2. 增殖能力变化

原代细胞的增殖能力相对较弱，但随着传代次数增加，细胞逐渐适应体外环境，增殖速度会加快。然而，当传代次数过高时，细胞可能会进入衰老状态，增殖能力急剧下降。例如，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）在P5左右时增殖速度最快，但到P10以上时，细胞增殖速度明显减慢，甚至停止分裂。

3. 代谢特性变化

细胞的代谢特性也会随着代次增加而改变。例如，原代培养的肝细胞在P0代次时，药物代谢能力与体内肝细胞较为接近，但随着传代次数增加，细胞的代谢酶活性可能会下降，导致药物代谢能力减弱。这种变化在药物筛选实验中尤为重要，因为高代次细胞可能无法准确反映药物在体内的代谢情况。

4. 基因表达谱变化

随着代次增加，细胞的基因表达谱会发生微调，以适应体外环境。例如，一些干细胞在多次传代后，可能会逐渐失去多能性相关基因的表达，而表达更多与增殖相关的基因。这种基因表达的变化可能会影响细胞的功能和实验结果。

（二）实验设计中的代次选择

在实验设计中，选择合适的细胞代次至关重要，因为不同代次的细胞可能表现出不同的生物学特性。以下是一些常见实验类型及代次选择的建议：

1. 基因表达分析

如果实验目的是分析细胞的基因表达谱，建议选择低代次（P1-P3）的细胞。低代次细胞的基因表达更接近体内状态，能够更准确地反映细胞的原始特性。例如，在研究细胞分化相关基因表达时，低代次细胞可以提供更可靠的基线数据。

2. 药物筛选实验

对于药物筛选实验，建议选择中等代次（P3-P5）的细胞。这些代次的细胞增殖能力较强，且代谢特性相对稳定，能够更好地反映药物的药理作用。例如，在筛选抗癌药物时，P3-P5代次的细胞可以提供更可靠的药物敏感性数据。

3. 细胞功能研究

如果实验目的是研究细胞的特定功能，如神经元的信号传导或肝细胞的代谢功能，建议选择低代次（P0-P2）的细胞。低代次细胞保留了更多的组织特异性功能，能够更准确地模拟体内环境。例如，在研究神经元的突触可塑性时，P0-P2代次的细胞更适合。

 4. 长期培养实验

对于需要长期培养的实验，如细胞衰老研究，可以选择高代次（P10以上）的细胞。高代次细胞更容易进入衰老状态，可以用于研究细胞衰老的机制和相关标志物。

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